RT-QPCR EasyTM Taqman One Step Real Time RT-PCR Master Mix

RT-qPCR EasyTM (خطوة واحدة) -Taqman

في الوقت الحقيقي PCR باستخدام (كدنا) ، الحمض النووي المنقى

مقدمة المنتج

تدرك منتجات سلسلة Foregene One-Step RT-PCR Easy التفاعل المتكامل من RNA إلى الحمض النووي مزدوج الشريطة ، أي اكتمال النسخ العكسي وتضخيم PCR في نفس أنبوب الطرد المركزي ونفس نظام التفاعل ، وبالتالي تبسيط الخطوات التجريبية ، تم تحسين الخطة التجريبية وتحسين الكفاءة التجريبية.

RT-qPCR EasyTM (خطوة واحدة) - Taqman باستخدام Foregene HotStar Taq DNA Polymerase ، يمكن لنظام Taqman qPCR المحسن إجراء الكشف الكمي في الوقت الحقيقي RT-qPCR لتتبع قوالب RNA.

شروط النقل والتخزين

• شروط النقل: يتم نقل العملية بأكملها في صندوق ثلج منخفض الحرارة لضمان أن المجموعة في حالة أقل من 4 درجات مئوية.
• شروط التخزين: يتم تخزين الطقم عند -20 درجة مئوية.قم بتخزين المنتج في ثلاجة بدرجة حرارة ثابتة عند -20 ℃ مباشرة بعد الاستلام.إذا كانت ظروف التخزين مناسبة ، فلن يؤدي المنتج إلى تدهور أي أداء خلال فترة الصلاحية التي تبلغ 1 عام.

معلومات مكون الطقم

• 2 × RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman: Foregene Reverse Transcriptase ، RNase Inhibitor ، Foregene HotStar Taq DNA Polymerase ، النسبة المثلى من dNTPs ، Mg2 + ، المثبت ، المحسن ، والمحسن.
• صبغة مرجعية ROX: تستخدم بشكل عام في أجهزة التدوير الحرارية لـ PCR في الوقت الحقيقي لشركات مثل ABI و Stratagene وما إلى ذلك ، لضبط الاختلاف بين أنابيب PCR الناتجة عن أخطاء تحميل عينة PCR.يختلف تركيز الصبغة المرجعية ROX التي تتطلبها الأدوات المختلفة ، ويمكن للمستخدم إضافتها وفقًا للتركيز الموصى به للأداة.

احتياطات:

يجب أن تتجنب الكواشف التجميد والذوبان المتكرر ، وإلا فإن أداء الكواشف سينخفض ​​أو يصبح غير صالح.

u يجب حماية الكواشف الموجودة في المجموعة من الضوء وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

u يوصى باستخدام استخراج عينة جديدة أو قالب RNA مخزّن في درجة حرارة -80 درجة مئوية (يجب أن يتجنب الحمض النووي الريبي تكرار التجميد والذوبان).

u لتجنب تلوث RNase ، يرجى إجراء التجربة في المساحة الخالية من RNase ؛يجب أن تكون أطراف الماصة وأنابيب PCR خالية من RNase ؛وارتداء القفازات والأقنعة التي تستخدم لمرة واحدة.

u يجب استخدام هذه المجموعة مع بادئات محددة لإجراء التجارب.يرجى تحديد البادئات المحددة للجين المراد تضخيمه وفقًا لاحتياجات التجربة.

u قبل الاستخدام ، ضع 2 × RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman على الجليد ليذوب تمامًا ونفض الغبار وخلط جيدًا قبل الاستخدام ؛يجب تشغيل إعداد النظام على حمام جليدي لتحسين أداء المجموعة وزيادة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.

تركيز قالب الحمض النووي الريبي

RT-qPCR EasyTM (خطوة واحدة) -Taqman: (1 pg-100 ng إجمالي الحمض النووي الريبي) / نظام 20 ميكرولتر.

دليل العمليه

ج: تحضير المواد والكواشف

• إعداد قالب الحمض النووي الريبي المحضر (من المستحسن استخدام مجموعات سلسلة Foregene Total RNA Isolation Kit لاستخراج وتنقية الحمض النووي الريبي) ، وأشعال محددة (10 ميكرومتر) والمواد الاستهلاكية والأدوات ذات الصلة.

ملاحظة: يرجى التأكد من سلامة الحمض النووي الريبي ومحاولة استخدام الحمض النووي الريبي المستخرج من العينات الطازجة.

• ضع 2 × RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman و RNase-Free ddH2O و 20 × ROX Reference Dye (إذا لزم الأمر) على الجليد للسماح له بالذوبان بشكل طبيعي ، ثم حرك جدار الأنبوب لخلط حتى الاستخدام.

ب: إعداد نظام RT-qPCR

2 × RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman مريح وسريع الاستخدام ، ويتجنب التلوث أثناء التشغيل والأخطاء التجريبية التي تسببها الاستعدادات المتعددة لنظام التفاعل إلى أقصى حد.عند الاستخدام ، نصف حجم نظام التفاعل فقط (على سبيل المثال ، إذا كان نظام التفاعل 20 ميكرولتر ، خذ 10 ميكرولتر 2 × RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman) ، أضف كمية مناسبة من قالب RNA وأشعال محددة ، وأضف RNase-Free ddH2O لتشكيل الحجم.يمكن أن يشير إعداد نظام رد فعل RT-qPCR المحدد إلى الجدول 1 أدناه.

الجدول 1: إعداد نظام RT-qPCR

ملحوظة: Forward Primer و Reverse Primer عبارة عن بادئات محددة للجين المستهدف.يمكن تعديل نظام qPCR وفقًا للاحتياجات التجريبية ونموذج PCR.للتركيز النهائي لمعظم البادئات ، نوصي بـ 400 نانومتر.يرجى ضبط جرعة البرايمر المحدد والمسبار وفقًا للتركيز المحضر وفقًا للتركيز النهائي الموصى به.بالنسبة لنظام qPCR مع نظام 50 مايكرولتر ، يرجى الرجوع إلى نظام 20 ميكرولتر لضبط كمية الكواشف بشكل متناسب.

1 *: اختر التركيز النهائي المناسب للصبغة المرجعية ROX وفقًا لأدوات PCR الكمية المختلفة.يظهر التركيز الأمثل للصبغة المرجعية ROX لأجهزة PCR الكمية الشائعة في الجدول التالي:

C: إعداد نظام رد فعل RT-qPCR

• بعد تحضير نظام RT-qPCR بالرجوع إلى الجدول أعلاه ، اخلط بلطف (يمكنك استخدام طرف ماصة للماصة برفق ؛ يمكنك أيضًا المزج على دوامة وطرد مركزي لفترة وجيزة لجمع السائل المنتشر على جدار الأنبوب أو غطاء الأنبوب ، ووضعه على صندوق الثلج لاستخدامه لاحقًا).
• الرجوع إلى إعدادات برنامج رد فعل RT-qPCR (الجدول 2) لضبط درجة الحرارة ووقت التفاعل.

ملاحظة: من أجل ضمان نشاط 2 × RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman وتحسين كفاءة التضخيم ، فمن الأفضل إعداد نظام رد فعل RT-qPCR بعد إعداد برنامج أداة PCR ، بحيث يمكن أن يكون برنامج التفاعل تم إدخالها فور اكتمال إعداد النظام.

• من أجل الحصول على أفضل تأثير qPCR ، يمكن استخدام التدرج PCR لتحسين ظروف التفاعل لقوالب مختلفة وأشعال مختلفة.

ملاحظة: نطاق درجة حرارة التمديد لـ Foregene Hotstar Taq DNA Polymerase المتوفرة في هذه المجموعة: 60-72 ℃ ، وأفضل درجة حرارة تمديد هي 72 ℃.

فيما يلي مثال على ظروف تفاعل RT-qPCR.يوصى باستخدام طريقة من خطوتين لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.عندما يكون تركيز القالب منخفضًا جدًا بحيث لا يتسبب في تضخيم غير محدد ، تؤدي قيمة التمهيدي المنخفضة Tm إلى كفاءة تضخيم منخفضة أو ضعف تكرار منحنى التضخيم ، وما إلى ذلك ، يوصى بتجربة طريقة الخطوات الثلاث لتفاعل PCR.ارجع إلى الجدول 2-1 (طريقة من خطوتين) والجدول 2-2 (طريقة من ثلاث خطوات) لتحديد شروط تفاعل RT-qPCR.

الجدول 2-1: إعداد برنامج تفاعل RT-qPCR (طريقة من خطوتين)

الجدول 2-2: إعداد برنامج رد فعل RT-qPCR (طريقة من ثلاث خطوات)

1 *: يمكن تعديل وقت النسخ العكسي وفقًا للاحتياجات التجريبية.تحتاج الجينات الداخلية العامة مثل β-Actin إلى 10 دقائق فقط ؛للكشف عن جينات معينة معبرة ، يمكن تمديد وقت النسخ العكسي بشكل مناسب حسب الحاجة.

2 *: اضبط وقتًا محددًا وفقًا لطول جزء الهدف المضخم.تبلغ سرعة التضخيم لـ Foregene HotStar Taq DNA Polymerase 2kb / min

ملاحظة: تختلف ظروف تفاعل PCR اعتمادًا على الظروف الهيكلية للقالب ، والبادئات ، وما إلى ذلك. بالنسبة لقوالب RNA ذات الهياكل الثانوية المعقدة ، يوصى باستخدام 42 ℃ للخطوة الأولى للنسخ العكسي.في العملية المحددة ، من الضروري تصميم ظروف التفاعل المثلى وفقًا للظروف المحددة مثل حجم الجزء المستهدف ، والتسلسل الأساسي للجزء المضخم ومحتوى GC وطول التمهيدي ، بما في ذلك درجة حرارة التلدين ، والتمديد الوقت ، إلخ.

تدفق العمل: