كيف يمكن تحسين كفاءة النسخ العكسي لـ LNCRNA؟

قيادة

RNA طويل غير مشفر ، lncRNA هو RNA غير مشفر بطول أكبر من 200 نيوكليوتيد ، بشكل عام بين 200-100000 nt.ينظم lncRNA التعبير الجيني عند المستويات اللاجينية والنسخ وما بعد النسخ ، ويشارك في إسكات كروموسوم X ، وطبع الجينوم وتعديل الكروماتين ، وتنشيط النسخ ، وتداخل النسخ ، والنقل النووي ، وتنظيم دورة الخلية ، وتنظيم تمايز الخلايا ، وتأثيرات تعويض الجرعة (الجرعة تأثير التعويض) والعديد من عمليات التنظيم المهمة الأخرى وثيقة الصلة بحدوث الأمراض البشرية وتطورها والوقاية منها ، وهي حاليًا واحدة من النقاط الساخنة في مجال الطب الحيوي.

01 أنواع وخصائص LncRNA

ينقسم lncRNA إلى عدة أنواع وفقًا لمصادر تكوينه المختلفة ، كما هو موضح في الشكل أعلاه.له الخصائص التالية:

1. عادة ما تكون lncRNAs أطول ، مع التعبير الديناميكي وطرق الربط المختلفة أثناء التمايز
2. بالمقارنة مع جينات الترميز ، عادة ما يكون للـ lncRNA مستوى تعبير أقل
3. معظم lncRNAs لها خصوصية تعبيرية زمنية ومكانية واضحة في عملية تمايز الأنسجة وتطورها
4. هناك تعبيرات مميزة في الأورام وأمراض أخرى
5. تتنوع المواقع الخلوية للـ lncRNA
6. التسلسل منخفض في الحفظ ، لكن الوظيفة لها درجة معينة من الحفظ ، إلخ.

02 الأسئلة المتداولة حول النسخ العكسي لـ LncRNA

نظرًا لانخفاض محتوى lncRNA في الخلايا ، وطولها وبنيتها عالية المستوى ، غالبًا ما يحتوي هذا الحمض النووي الريبي على هياكل معقدة مثل الحلقات الجذعية أو دبابيس الشعر ، ويكون RT-qPCR عرضة لمشاكل النسخ العكسي غير الناجح أو الكفاءة المنخفضة.

03 محلول النسخ العكسي LncRNA

في القاعدة المركزية ، تسمى عملية فيروسات الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي الخاص بها لتخليق الحمض النووي باستخدام الحمض النووي الريبي كقالب النسخ العكسي.تسمى عملية استخدام النسخ العكسي لفيروس الحمض النووي الريبي لتوليف قالب (كدنا) في المختبر النسخ العكسي.العناصر الرئيسية المدرجة في نظام النسخ العكسي: قالب RNA ، النسخ العكسي ، الاشعال والمكونات الأخرى.

1. قالب الحمض النووي الريبي

ينعكس تأثير قالب الحمض النووي الريبي على النسخ العكسي في هيكله ونقائه وسلامته.كلما زادت درجة نقاء وسلامة الحمض النووي الريبي المستخرج ، زادت كفاءة النسخ العكسي وزادت دقة النتائج الكمية اللاحقة.غالبًا ما يحتوي الحمض النووي الريبي المنقى بواسطة كواشف استخراج الحمض النووي الريبي المستخدمة بشكل شائع على بقايا من الكحول وأملاح الغوانيدين ، والتي لها تأثير مثبط قوي على معظم النسخ العكسية.

2-إنزيم النسخ العكسي

النسخ العكسي له تأثير رئيسي في نظام النسخ العكسي بأكمله.درجة الحرارة المناسبة للنسخة العكسية المستخدمة في معظم المعامل هي بشكل عام 42 درجة مئوية.في الواقع ، يتطلب فتح بنية الحمض النووي الريبي عالي المستوى درجة حرارة أعلى ، ومتطلبات النسخ العكسي أعلى.

3. التمهيدي

تشتمل بادئات النسخ العكسي على بادئات خاصة بالجينات ، وبادئات عشوائية ، وبادئات Oligo dT.لا تحتوي معظم lncRNAs على ذيول بولي أ ، ومن المهم مطابقة البادئات العشوائية بشكل صحيح مع Oligo dT.

4. مكونات أخرى

في ضوء حقيقة أن الحمض النووي الريبي سهل التحلل بشكل خاص ، يمكن تقليل إدخال المكونات في نظام النسخ العكسي ، مما يمكن أن يمنع بشكل فعال دخول RNase ويضمن التقدم السلس للنسخ العكسي.

يحصل Foregene من قالب RNA ، والنسخ العكسي إلى qPCR يرافق بشكل شامل اكتشاف lncRNA

طقم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي الحيواني (مع عمود إزالة جدنا)

طقم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي للخلايا (مع عمود إزالة جدنا)

Lnc-RT HeroTM I (مع gDNase) (Super Premix لتوليف cDNA من أول حبلا من lncRNA)

Real Time PCR EasyTM-SYBR Green I

مزايا استخراج الحمض النووي الريبي:

تستخدم المجموعة تقنية استخراج الحمض النووي الريبي من الجيل الثالث ، ولا داعي لاستخدام DNase.

11 دقيقة من 96 و 24 و 12 و 6 خلايا مستنبتة ذات ألواح جيدة ، واستخراج عالي الكفاءة من الحمض النووي الريبي الخلوي الكلي الخالي من الحمض النووي الريبي الخالي من الحمض النووي الريبي وعالي النقاء وعالي الجودة.

مزايا النسخ العكسي لـ lncRNA:

نظام نسخ عكسي تم تطويره خصيصًا لـ LncRNA لإزالة تلوث الحمض النووي بسرعة.

يتمتع نظام النسخ العكسي باستقرار حراري عالٍ ولا يزال يتمتع بأداء نسخ عكسي جيد عند 50 درجة مئوية.

يمكن عكس القوالب ذات المحتوى العالي من GC والبنية الثانوية المعقدة بكفاءة عالية.

مزايا qPCR:

البداية الساخنة Foregene Taq Polymerase لديها كفاءة تضخيم أعلى وحساسية تضخيم أعلى وخصوصية تضخيم أعلى.

يجعل Real PCR Easy Mix المحسن SYBR Green I لديه حساسية أعلى للكشف ، وكثافة الفلورة الخاصة به هي 3-5 مرات من المنتجات المماثلة ، والتي يمكن أن تلبي احتياجات أنواع مختلفة من التجارب الكمية الفلورية.